SEJOUR DECOUVERTE
Analyse Bio-informatique de génomes

• I. Connection au serveur ESILBAC et pratique de LINUX
• II. Rechercher les séquences des génomes de Listeria dans GENBANK
• III. Manipuler les fichiers de séquences
• IV. Rechercher les gènes dans les séquences avec EMBOSS
• V. Rechercher les "vrais" gènes avec BLAST
• VI. Trouver de l'information sur les génomes avec GENBANK
• VII. Rechercher les gènes de virulence avec Artemis ACT
• VIII. Visualisation de la structure 3D des protéines sélectionnées avec PDB et PyMol
• Guide de survie dans le terminal

I. Connection au serveur ESILBAC et pratique de LINUX

Branchement à SIM

1. Se brancher à SIM (PC Windows) au M-6

Branchement aux serveurs ESILBAC via Hummingbird

1. Double-cliquer sur le répertoire Logiciels spécialisés situé sur le bureau
2. Double-cliquer sur le répertoire Hummingbird
3. Choisir xdm_esilbac1 ou xdm_esilbac2
4. Inscrire son code d'accès et son mot de passe

Linux

Pratiquons quelques commandes de LINUX

1. Voir la liste des fichiers dans un répertoire
   ls: list (engl) = dresser une liste (fr)

   ls

2. Créer un répertoire
   mkdir : make directory (engl) = créer un répertoire (fr)

   mkdir sejour_decouverte

3. Visiter un répertoire
   cd: change directory (engl) = se déplacer dans l'arborescence (fr)

   cd sejour_decouverte

4. Monter dans un répertoire

   cd ..

5. Déterminer l'endroit où l'on se trouve dans l'arborescence
   pwd: print working directory name (engl) = inscrire le nom du répertoire à l'écran (fr)

   pwd

6. Compléter une commande, un nom de fichier lorsqu'on en tape les premières lettres
   Touche tab

II. Rechercher les séquences des génomes de Listeria dans GENBANK

1. Ouvrir un navigateur (firefox, ...)
   1. Dans une fenêtre de terminal, en utilisant la commande suivante:

      firefox &

   2. OU via l'interface graphique en cliquant sur l'icone du programme
2. Se connecter sur le site ftp de GENBANK dédié aux bactéries en tapant l'adresse suivante dans le navigateur:
   ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria
3. Cliquer sur le dossier Listeria_innocua
   Cliquer avec le bouton droit de la souris sur les fichiers suivants et enregistrer sous format texte (Enregistrer la cible du lien sous ou save link target as ou save link as) dans votre répertoire en les renommant comme ci-dessous :
   • NC_003212.faa renommé en lin_genes_prot.txt
   • NC_003212.ffn renommé en lin_genes_dna.txt
   • NC_003212.fna renommé en lin_genome_dna.txt
4. Revenir en arrière et cliquer sur le dossier Listeria_monocytogenes
   Cliquer avec le bouton droit de la souris sur les fichiers suivants et enregistrer sous format texte (Enregistrer la cible du lien sous ou save link target as ou save link as) dans votre répertoire en les renommant comme ci-dessous :
   • NC_003210.faa renommé en lmo_genes_prot.txt
   • NC_003210.ffn renommé en lmo_genes_dna.txt
   • NC_003210.fna renommé en lmo_genome_dna.txt

III. Manipuler les fichiers de séquences

Nous allons afficher successivement dans le terminal le contenu des trois fichiers pour Listeria monocytogenes (lmo) en utilisant le programme more qui sert à afficher les premières lignes d'un fichier.

1. Afficher les premières lignes du génome de Listeria monocytogenes en tapant la commande suivante :

   more lmo_genome_dna.txt

   - La barre [ Espace ] affiche la suite du fichier
   - La touche [ q ] permet de quitter le programme
   Remarquer le format particulier de ce fichier avec la première ligne commençant par un > ; il s'agit d'un fichier en format fasta
2. Afficher le fichier contenant les gènes de Listeria monocytogenes

   more lmo_genes_d2na.txt

   Remarquer que les séquences nucléiques des gènes sont en format fasta
3. Afficher le fichier contenant les protéines de Listeria monocytogenes

   more lmo_genes_prot.txt

   Remarquer que les séquences protéiques des gènes sont en format fasta
4. Maintenant, nous allons compter le nombre de gènes dans le génome de Listeria monocytogenes. Pour ce faire nous allons tirer parti du format fasta et de la puissance de l'outil grep. Ce dernier cherche dans un fichier spécifié un patron demandé (un mot, une phrase, un caractére, etc.).

   grep -c '>' lmo_genes_dna.txt

   -c : cette option donne comme résultat le nombre de lignes qui vérifient la recherche
   '>' : patron, motif
   lmo_genes_dna.txt : fichier d'entrée dans lequel s'effectue la recherche
5. Compter le nombre de gènes dans le génome de Listeria innocua

   grep -c '>' lin_genes_dna.txt

IV. Rechercher les gènes dans les séquences avec EMBOSS

Nous allons rechercher dans une portion de la séquence du génome de Listeria monocytogenes tous les gènes potentiels. On utilisera une règle simple (cf ci-dessous). Cette règle ne permet pas de trouver la totalité du gène (qui commence un peu avant et se termine après) mais la partie qui donnera la protéine. Cette portion est appelée ORF pour "Open Reading Frame" (phase ouverte de lecture) ou CDS pour "Coding sequence" ( séquence codante) lorsque la structure du gène est confirmée.

1. Charger EMBOSS

   module load emboss

2. Visualiser la liste des programmes disponibles dans EMBOSS

   wossname

   Cliquer deux fois sur la touche [ Enter ]
   La liste des programmes disponibles dans EMBOSS apparait, triée par catégories.
   Dans la catégorie EDIT, se trouve le programme extractseq pour extraire une portion de la séquence d'ADN.
   Dans la catégorie NUCLEIC GENE FINDING se trouve le programme plotorf qui recherche les ORFs.
3. Extraire, avec le programme extractseq (EDIT) sla sous-séquence de 450 000 à 460 000 chez Listeria monocytogenes et la copier dans le fichier lmo_genome_450-460_dna.txt

   extractseq lmo_genome_dna.txt -regions 450000-460000 -outseq lmo_genome_450-460_dna.txt

   lmo_genome_dna.txt : fichier d'entrée
   -regions 450000-460000 : on extrait la portion 450000 à 460000
   -outseq lmo_genome_450-460_dna.txt fichier de sortie qui contient les 10 000 bases extraites
4. Utilisons le programme plotorf (NUCLEIC GENE FINDING) en mode interactif

   plotorf

5. Indiquer le nom du fichier contenant la sous-séquence de Listeria monocytogenes (lmo) lorsque le programme vous le demande

   Input sequence : lmo_genome_450-460_dna.txt

6. Indiquer le format de sortie

   Graph type [x11]: png

7. Le programme indique qu'il a créé le fichier de sortie plotorf.1.png. Pour visualiser ce fichier, utiliser la commande display

   display plotorf.1.png

V. Rechercher les "vrais" gènes avec BLAST

Notre programme a prédit beaucoup de gènes dont beaucoup sont chevauchants. Nous allons extraire toutes les protéines traduites à partir des ORFs prédites et rechercher s'il existe déjà des gènes similaires connus.

1. Dans une fenêtre de terminal : créer un fichier avec toutes les protéines traduites à partir des ORFs trouvées avec la commande getorf

   getorf lmo_genome_450-460_dna.txt -outseq lmo_genome_450-460_ORF_prot.txt -find 1

   lmo_genome_450-460_dna.txt : fichier d'entrée qui contient la séquence dans laquelle on va chercher les ORFs
   -outseq lmo_genome_450-460_ORF_prot.txt : fichier de sortie qui contient les ORFs protéiques
   -find 1 option pour traduire les ORFs en protéines
2. Dans un navigateur (firefox, ...) : aller sur la page BLAST du NCBI
   http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
   Sur la page qui s'affiche:
   1. Dans la section Basic BLAST, cliquer sur le lien protein BLAST
   2. Dans la section Enter Query Sequence, cliquer sur [ Browse ] pour charger le fichier lmo_genome_450-460_ORF_prot.txt
   3. Dans la section Choose Search Set
      • Pour le paramètre Organism, indiquer la valeur 2, cela limitera la recherche de protéines similaires aux bactéries
      • Pour l'option Exclude, cocher Uncultured/environmental sample sequences, pour accélérer la recherche
   4. Dans la section Algorithm parameter (sous le gros bouton bleu [ BLAST ])
      Cliquer sur la flèche pour afficher le contenu
      • Dans la section General Parameters, pour le paramètre Max target sequences, changer la valeur à 10 pour ne pas être submergé par les résultats
   5. Cliquer sur le bouton bleu [ BLAST ] pour lancer l'outil
      La recherche peut prendre plusieurs minutes

VI. Trouver de l'information sur les génomes avec GENBANK

L'annotation des deux génomes de Listeria qui nous intéressent a déjà été réalisée par des experts de cette espèce. Lorsque l'annotation a été terminée, les équipes de recherche ont publié un article scientifique pour présenter leur travail et ont déposé l'annotation dans les banques de données publiques dont GENBANK fait partie. Nous allons rechercher les informations sur l'annotation de ces bactéries.

1. Allez sur le site Entrez via l'adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/
2. Cliquer sur Genome : whole genome sequences dans la colonne de gauche
3. Dans la zone de recherche Search for indiquer Listeria[orgn], puis cliquer sur [ Go ]
4. Sélectionner les items 5 et 6 : NC_003212 et NC_003210
5. En haut de la page, dans le menu Display, sélectionner Overview
   La page se recharge automatiquement en affichant les informations pour les deux organismes sélectionnés

VII. Rechercher les gènes de virulence (dangereux) avec Artemis ACT

1. Aller sur le site des ressources en microbiologie (IMG : Integrated Microbial Genomes) du JGI
   http://img.jgi.doe.gov/
2. Dans le menu en haut de la page, cliquer sur Compare Genomes
3. Dans le sous-menu qui s'est affiché, cliquer sur Synteny viewers.
4. Une liste d'outils s'affiche, cliquer sur Artemis-ACT.
5. Sur la page ACT Genome Selection, sélectionner (en maintenant la touche Ctrl) les espèces : Listeria innocua Clip 11262 et Listeria monocytogenes EGD-e.
   Cliquer sur [ Next ]
6. Sur la page Pairwise selection, cliquer sur [ Next ].
7. Sur la page Contig Reorder - Artemis - ACT, Dans la colonne Ignore du 2e tableau, cocher la seconde ligne :
   2 NC_003383 Listeria innocua Clip11262 plasmid pLI100: NC_003383
   Ceci écartera le plasmide de l'analyse
   Cliquer sur [ Next ].
   Le programme lance des processus ...
8. Lorsqu'une nouvelle page intitulée Artemis - ACT s'affiche, cliquer sur le bouton [ Run ACT ] qui lancera une application en Java Web Start.
9. L'application ACT affiche en haut de la page, le génome de Listeria innocua et en bas celui de Listeria monocytogenes avec leurs annotations dans les 6 phases de lecture.
   S'il existe de fortes similarités entre deux portions de génome, une barre rouge les relie.
   Les barres de défilement horizontales tout en haut et tout en bas de la fenêtre permettent de se déplacer sur le génome. Le déplacement est coordonné entre les deux génomes.
   Utiliser les barres de défilement horizontal afin d'afficher à l'écran la portion de génome sur laquelle nous avions recherché les ORFs, c'est à dire la portion 450000 à 460000 sur le génome de Listeria monocytogenes.

VIII. Visualisation de la structure 3D des protéines sélectionnées avec PDB et PyMol

1. Se connecter sur le site de la PDB
   http://www.pdb.org/
2. Dans le champs texte de recherche en haut de page, indiquer 2OMT (la lettre O)
   Puis, cliquer sur le bouton Search
   La fiche de la structure cristallographique de la protéine sélectionnée et de la Cadherine, son récepteur sur les cellules humaines s'affiche.
3. Dans le menu à droite, choisissez Download Files puis PDB File (Text).
   Le fichier est sauvé sous le nom 2OMT.pdb.
4. Nous allons utiliser le programme de visualisation moléculaire Pymol afin de l'observer en 3D.
   Dans une fenêtre de terminal , taper

   pymol

5. Dans la petite fenêtre grise, faites File > Open pour ouvrir le fichier 2OMT.pdb
   Puis, dans la fenêtre Pymol viewer, dans le menu à droite, sélectionner :
   • S(show) et cartoon
   • H(hide) et lines
   • H(hide) et waters
   • C(color) spectrum et rainbow

L'annotation et le métier de bio-informaticien

Guide de survie dans le Terminal

	NOTES 
	------		
	1 / La touche [ TAB ] permet de completer une commande, un nom de fichier lorsqu'on en tape les premieres lettres
	2 / Il faut taper sur la touche [ Entrer ] a la fin de chaque commande pour la valider
	3 / La casse compte : 'monfichier.txt' est different de 'Monfichier.txt'
	4 / Utiliser les fleches haut et bas pour se deplacer dans l'historique de commande
	
	!!!!! Le signe '>' indiquera qu'il faut taper la commande qui le suit ; il ne faut pas l'ecrire !!!!!!!
	
	ARBORESCENCE
	------------
	/				C'est le repertoire le plus bas, la "racine"
	|------	A
		|------ a
		|------ b
			|------ fichier1.txt
	|------	B
	
	Pour indiquer un chemin, on separe les repertoires par des "/".
	Par exemple, le chemin depuis la racine jusqu'au "fichier1.txt" est : /A/b/fichier1.txt
	
	
	OU SUIS-JE ?
	-------------
	> pwd			Position dans l'arborescence des fichiers
	> cd 			Revenir dans son repertoire initial ("home")
	> cd monrepertoire/	se deplace dans le sous-repertoire "monrepertoire"
	> cd ..			Remonte d'un repertoire
	> cd ../..		Remonte de 2 repertoires
	> ls			Fait la liste du contenu du repertoire courant (en lignes)
	> ls -l			Fait la liste du contenu du repertoire courant (sous forme de liste)
	
	FICHIER
	--------
	> touch toto.txt	Cree le fichier toto.txt (dans le repertoire dans lequel on se trouve)
	> more toto.txt		Affiche le contenu du fichier toto.txt par page
				[ Espace ] pour faire defiler le fichier
				[ q ] pour quitter
	> cat toto.txt		Affiche TOUT le contenu du fichier toto.txt. Attention aux fichiers tres longs !
	> rm toto.txt		Supprime le fichier toto.txt
				A la demande de confirmation, taper [ y ] pour valider
	
	REPERTOIRE
	----------
	> mkdir tata		Cree le repertoire "tata" dans le repertoire dans lequel on se trouve
				
	KES C CA ?
	----------
	> man macommande	Affiche le manuel pour la commande "macommande". 
				Ex: > man more
	
	AIE AIE AIE
	-----------
	ctrl + c		*Arreter* la commande en cours
	ctrl + z		*Interrompre* la commande en cours
					> fg 	pour la relancer
					> bg	pour la relancer en arriere plan
	
	COMMANDES AVANCEES
	---------------------
	> grep "motif" fichier		*Affiche* les lignes contenant "motif" dans "fichier" 
					Ex : grep "ribosomal" lmo_genes.dna	Recherche les lignes du fichier "lmo_genes.dna" qui contiennent le mot "ribosomal"
	> grep -c "motif" fichier	*Compte* les lignes contenant "motif" dans "fichier"